灵芝多糖的常规提取方法已有报道，这些方法不仅费时，而且收率很低。目前，超声技术已广泛应用于中药有效成分的提取，作者采用该方法提取灵芝多糖，不仅大幅度提高了有效成分的提取率，节省溶剂，简化提取步骤，而且避免了高温对有效成分的破坏。为探讨灵芝多糖超声法好的提取条件，采用正交设计对其提取工艺进行了试验研究。

1　仪器与材料

　　超声波提取罐JP600G（武汉嘉鹏电子有限公司）；双光束紫外可见分光光度计760 CRT（上海光学仪器厂）；高速中药粉碎机HX-200型（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；旋转蒸发仪RE-52 A （上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅；索氏提取器；高速离心机。

　　灵芝由国家科技部泰山赤灵芝GAP种植基地提供，经山东中医药大学徐凌川副教授鉴定为Gan- o&mla lucidum Kalst；新配0.2%葱酮醋酸乙酯试剂，无水葡萄糖对照品（105℃干燥恒重）及其他分析纯试剂。

2　方法与结果

2.1　灵芝多糖的提取与精制

　　称取灵芝粉末30g,乙醚480mL回流脱脂2 次，每次1h;再用甲醇480mL回流提取2次，每次1 h。药渣加水360mL,沸水浴提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，高速离心机2400r·min-1，离心20 min。减压浓缩至350mL，活性炭脱色，过滤，滤液加乙醇使其含醇量达百分之八十，放置过夜，抽滤，沉淀以 200 mL水溶解重复醇沉1次。沉淀分别以无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，60℃干燥，即得灵芝多糖。

2.2 标准曲线的制备

2.2.1 0.1%葡萄糖标准液的配制 精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖0.1g,配成100mL溶液，即得 0.1％葡萄糖标准液。

2.2.2 0.2%蒽酮-醋酸乙酯显色剂的配制　精密称取0.4g蒽酮，溶于200mL醋酸乙酯，摇匀，置于棕色瓶中保存。

2.2.3　多糖吸收波长的测定　精密吸取0.1% 葡萄糖标准液1.0mL，用蒸馏水定容至50mL，取1 mL放于干燥的10mL具塞试管中，再加入4mL浓 H2SO4，摇匀，5min后加1mL 0.2%蒽酮-醋酸乙酯， 100℃水浴加热10min取出，放至室温。扫描条件：狭缝2.00nm，采样间隔1.00nm，在500～700nm进行慢速扫描。测得灵芝多糖的吸收波长可达618 nm，吸光度为0.116，透过率为76.6%。

2.2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取0.1%葡萄糖标准液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，用蒸馏水分别定容至50mL，分别取1mL加入干燥的6支 10mL具塞试管中，并编号，再分别加入4mL浓硫酸，摇匀，5min后加1mL 0.2%蒽酮-醋酸乙酯，100 ℃水浴10min取出，放至室温。取1mL蒸馏水，以浓硫酸为空白对照，618nm测吸光度。以吸光度为纵坐标，无水葡萄糖含量为横坐标制标准曲线，回归方程为A＝0.006 6×C-0.0739，r=0.9992，表明 20～120μg·mL-1线性关系良好。

2.3 换算因素的测定

　　精密称取灵芝多糖18.00mg,置100mL量瓶中，蒸馏水溶解并定容至刻度，取2mL用蒸馏水定容至10mL，得多糖供试液。精密吸取1mL，按标准曲线项下的方法测定吸光度，计算出多糖溶液中葡萄糖的含量，并计算出换算因子f =W/CD。式中 W为多糖量（μg），C为多糖溶液中葡萄糖的含量，D 为灵芝多糖的稀释因素。测得f=1.7948.

2.4 正交试验设计

　　以温度、料液比（药材：水）、提取时间为因素，设计3因素,3水平的L9（34）试验，见表1。

表1　因素及水平

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A B C

水平　 温度　 时间　 药材:水

/℃ /min

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1 40 20 1:10

2 50 40 1:20

3 60 60 1:30

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2.5 正交试验结果

　　精取灵芝3g,按正交试验表所列条件，超声提取2次，过滤，合并提取液，浓缩并定容至100mL。精密吸取0.15mL，加水0.85mL，按标准曲线项下的方法测定吸光度，计算出供试液中葡萄糖的含量，并计算多糖含量(％)=CDF/W×100。式中C为供试液中葡萄糖的浓度（μg·mL-1），D为供试品溶液的稀释因子,f为换算因子，W为供试品重量（μg）。试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 试验结果

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No. 多糖含量/％

1 2.3953

2 2.6443

3 2.9177

4 3.1435

5 2.5129

6 3.2448

7 2.4773

8 2.5679

9 2.3584

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表3 方差分析结果

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方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F P

A 0.3823 2 0.1911 1.097 ＞0.05

B 0.1081 2 0.0540 0.310 ＞0.05

C 0.3484 2 0.1742 0.048 ＞0.05

误差 0.0168 2 0.0083

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注：F0.05(2，2)＝19.00

　　以多糖含量百分数为考察指标，各因素作用主次为A＞B＞C。方差分析表明，A，B，C3因素对结果均无显著性影响，故依据直观分析结果，结合生产成本，选择灵芝多糖的好的提取工艺为 A2B1C1，即10倍量水50℃超声提取2次，每次20min。

2.6　多糖含量测定

2.6.1　常规方法　精取灵芝粉末5g,乙醚100mL 回流脱脂2次，每次1h;再用甲醇100mL回流提取 2次，每次1h。药渣加水80mL,沸水浴提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，高速离心机2 400r· min-1，离心20min。上清液减压浓缩至60mL，加乙醇使其含醇量达百分之八十，放置过夜，抽滤，沉淀以水溶解并定容至100mL。精密量取0.15mL，加水0.85 mL，按标准曲线项下的方法测定吸光度，计算出多糖含量为1.60％。

2.6.2 超声方法 精取灵芝粉末3g,加10倍量水 50℃超声提取2次，每次20min，合并提取液，过滤，浓缩并定容至100mL，作为样品供试液。精密吸取 0.15mL,加水0.85mL，按标准曲线项下的方法测定吸光度，计算出灵芝多糖含量为2.57%，较常规方法提高60.61％。

3 讨论

3.1 本研究采用正交试验，根据方差分析和生产实际情况确定了灵芝多糖超声提取好的工艺，即 10倍量水50℃超声提取2次，每次20min;并且考察了该方法的可行性和实用性，若确定以灵芝多糖作为质量检测指标时，灵芝多糖的提取可用该方法进行。

3.2 比较了常规提取和超声提取灵芝多糖的差异，结果发现用超声提取灵芝多糖具有较大的优势：提取时间缩短5倍以上，收率提高百分之六十以上；提取全过程无需高温，避免了因高温对灵芝多糖分子结构的分解，而常规提取会破坏多糖的分子结构降低多糖的活性；所用仪器简单，操作方便，超声波仪自动化程度很高，便于大规模生产。 （中国中药杂志第30卷第6期）

　　产品型号：JP600G型超声波提取/乳化机组

　　机型结构：超声波发生器与提取罐分体式

　　超声频率：28KHz

　　超声峰值功率：1000W （由原600W升级至1000W，价格不变）

　　提取罐内尺寸：直径320 ×高250mm

　　提取罐容积：小于等于20L

　　搅拌电机功率：15W

　　搅拌电机转速：10-30转/min（可调）

　　电加热功率：2KW

　　供电电源：220VAC 50HZ 

　　具有数显时钟可调功能

　　具有数显功率可调功能

　　具有数显扫频可调功能

　　具有数显温度可调功能

　　武汉嘉鹏电子有限公司专业致力于超声波提取/萃取、超声波乳化、超声波清洗、超声波污水处理、超声波酒类醇化产品的研发、生产及销售。公司拥有多项技术。其中“数字式大功率多用途超声波电源系统”获武汉市重大科技成果奖。数字扫频实现了用户迫切需要的变频要求的同时还弥补了早期双频或多频技术带来的超声转换效率很低的弊端。此项技术经由全国各大院校的用户使用后反应很好。应用于植物提取、乳化、污水处理等领域，院校包括：清华大学、北京大学、浙江大学、华中科技大学、武汉大学、华中师大、中国地质大学、武汉科技大学、上海交大、浙江工业大学、兰州大学、河南农业大学、武汉化工学院、吉林大学、四川大学、华南理工大学、华东理工大学、江汉大学、长江大学、中科院武汉植物所、昆明植物所、中科院过程所、中科院武汉物理所、武汉市药检所等。公司产品行销全国除港、澳、台外的所有省份及直辖市。售后方面：公司产品使用自主技术故性能稳定、质量很好。公司承诺5年内免费质保。用户采用超声波需注意的事项：超声波提取方面：一、被提取物需粉碎到20目或更细。粉碎越细得率越高。二、选用合适的提取溶剂。三、根据产品的特性和产量合理的安排提取工艺。

　　超声波乳化方面：一、乳化液的配方包括乳化剂的用量。二、乳化时间的选定，并不是时间长就越好，乳化过程是分散和聚合不停的循环的过程。按现有试验结果显示10－15分钟的乳化粒径可达100纳米。

　　重要的是数字扫频的选择，此项共有16档选择，数值越低则气泡越粗、力量越大；数值越高则气泡越细、力量越小。不同的提取或乳化物质改变数字扫频会带来不同的效果及效率。

　　超声波提取天然产物包括超声波提取多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、树脂、胶体物、木质素、维生素、脂肪、油脂、蜡、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、甾体化合物、抗生素类等。